Изучены иммуногистохимические (ИГХ) особенности экспрессии протеина Claudin 11 в ткани яичка 28 больных при экскреторно-обтурационной и секреторной формах мужского бесплодия. Обнаруженное достоверное снижение уровня ИГХ-экспрессии протеина Claudin 11 при секреторной форме мужского бесплодия и синдроме "только клетки Сертоли" по сравнению с экскреторно-обтурационным бесплодием. Результаты свидетельствуют о значительных нарушениях гематотестикулярного барьера, которые являются основой развития дополнительного иммунного компонента и углубление патологических изменений ткани яичка у больных при секреторной форме мужского бесплодия. Ключевые слова: мужское бесплодие, протеин Claudin 11.

В мужской репродуктивной системе существует гематотестикулярный барьер, образованный плотными контактами между клетками Сертоли (главный компонент) и структурами, которые отделяют зрелые сперматозоиды от периферической крови и предотвращают их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками. Различные факторы, нарушающие этот барьер, приводят к возникновению иммунных реакций с образованием в крови антител к эпителию семенных канальцев и развития аутоиммунного бесплодия, поскольку сперматозоиды появляются в период полового созревания уже после того как сформировалась иммунная толерантность к собственным тканям организма. Антиспермальные антитела - это иммуноглобулины G, А и М, которые при взаимодействии со сперматозоидами способны их зафиксировать, аглютинизировать, блокировать процесс пенетрации (проникновение) в яйцеклетку, исключая процесс оплодотворения, или блокировать процесс имплантации эмбриона, даже в случае использования вспомогательных репродуктивных технологий. Лабораторная диагностика иммунной бесплодности на сегодняшний день включает исследование крови и семенной жидкости в антиспермальные антитела - иммуноглобулины G, А и М, хотя эти иммуноглобулины не являются специфичными маркерами аутоиммунного бесплодия. Кроме того, гематотестикулярный барьер выполняет трофическую функцию, а также обеспечивает в канальцах специфическую гормональную среду, необходимую для сперматогенеза. В связи с этим, нарушение гематотестикулярного барьера - важный фактор возникновения нарушений сперматогенеза (олиго-терато-и азооспермии). Поэтому состояние гематотестикулярного барьера - важный диагностический и прогностический фактор, который необходимо учитывать при лечении мужского бесплодия.

Молекулярными исследованиями последних лет установлено, что трансмембранные белки семейства claudins составляют основу межклеточных плотных запирающих контактов, образующих тканевые барьеры, в том числе гематотестикулярный барьер, существующий в мужской репродуктивной системе. Результаты недавно проведенных исследований свидетельствуют, что протеин Claudin 11, который экспрессирует преимущественно в плотных контактах между клетками Сертоли играет важную роль в регуляции гематотестикулярного барьера и может быть как маркером состояния гематотестикулярного барьера и сперматогенеза при мужском бесплодии различной этиологии.

Исследованый материал 28 больных азооспермией, полученный при инцизионной биопсии с последующим гистологическим и иммуногистохимическое исследование биоптата. Для установления клинического диагноза формы бесплодия пользовались общепринятой классификацией. При определении окончательного диагноза учитывали данные морфологического исследования биоптата яичка и результаты гормональных исследований. Согласно установленным диагнозам пациенты были разделены на три группы:

• 1-я группа - 11 больных, у которых был установлен диагноз экскреторно-обтурационное бесплодие. Средний возраст больных - 33,6 года.
• 2-я группа - 12 пациентов, у которых был установлен диагноз секреторное бесплодия с блоком сперматогенеза на уровне сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2-го порядка или сперматид. Средний возраст больных - 29,5 года.
• 3-я группа - 5 пациентов, у которых был установлен диагноз секреторного бесплодия с синдромом «только клетки Сертоли». Средний возраст больных - 28,5 года.

Для гистологического исследования биоптаты ткани яичка фиксировали в жидкости Буэна и заливали в парафин. С парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 мкм., которые окрашивали гематоксилинэозином.

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ осуществляли с использованием стандартного авидинбиотинового метода. Для ИГХ-исследования биоптаты фиксировали в 12% забуференный формалин, заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной до 5 мкм. Срезы инкубировали с первичными антителами Claudin 11 (DAKO, Glostrup, Дания) в разведении 1:50. В конце препараты проявляли 1-2 мин. в 0,05% растворе диаминбензидина (DAB), докрашивают гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Как положительный контроль использовали срезы тканей с известным заранее высоким содержанием Claudin 11. Те же срезы служили отрицательным контролем, но без обработки первичными антителами. В каждом случае для ИГХ-исследования анализировали 12-16 срезов. Распространенность и интенсивность ИГХ-реакции оценивали полуколичественным методом в баллах. Распространенность реакции или количество поокрашенных ядер или цитоплазмы клеток оценивали от 0 до 3 баллов по следующим критериям: 0 - отсутствие клеток с видной окраской, 1 - окрашено менее 10% клеток, 2 - окрашено более 10%, но менее 50% клеток, 3 - равномерно окрашено более 50% клеток клеточного слоя. Интенсивность окраски ядер или цитоплазмы оценивали по следующим критериям: 0 - отсутствие видимой окраски, 1 - слабо окрашенные ядра или цитоплазма, 2 - умеренно окрашены ядра или цитоплазма, 3 - интенсивно окрашенные ядра или цитоплазма. Общий результат ИГХ-реакции определяли по показателям иммуногистохимического коэффициента (ИГХК) от 0 до 9 баллов, который получали перемножением оценок распространенности и интенсивности окраски. Проводили статистический анализ полученных результатов. При исследовании ИГХ-экспрессии протеина Claudin 11 в группе больных экскреторно-обтурационное бесплодие с сохраненным сперматогенеза (всего 11 пациентов), наблюдали умеренное мембранозно-цитоплазматические окраски (4-6 баллов) клеток Сертоли в 6 наблюдениях (54,5%), в 5 случаях (45,5%), было обнаружено выраженную мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 (7-9 баллов). Среднее значение ИГХК равнялось 7,4 ± 0,45 балла.

Клетки сперматогенного эпителия - сперматогоний, сперматоциты 1-го и 2-го порядка проявляли слабую мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 в 1-3 балла во всех 11 наблюдениях (100%) данной группы. Среднее значение ИГХК составило 2,1+0,18. Необходимо отметить, что сперматиды и зрелые сперматозоиды характеризовались отсутствием ИГХ-экспрессии протеина Claudin 11 (0 баллов) во всех 11 случаях (100%).

В эндотелиальных клетках перитубулярных гемокапилляров проявляли выраженную мембранозно-цитоплазматичную экспрессию протеина Claudin 11 (7-9 баллов) в 5 случаях (45,5%), а в 6 наблюдениях (54,5%) данной группы наблюдали умеренную мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 в 4-6 баллов. Среднее значение ИГХК равнялось 7,2 ± 0,45 балла.

В группе больных с секреторным бесплодием с блоком сперматогенеза на уровне сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2-го порядка или сперматид (всего 12 пациентов) наблюдали умеренную мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 (4-6 баллов) в клетках Сертоли в 8 наблюдениях (66,7%) в 4 случаях (33,3%) было выявлено слабую мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 (1-3 балла) в сустентоцитах. Среднее значение ИГХК составило 5,43 +0,42.

Клетки сперматогенного эпителия - сперматогоны и сперматоциты 1-го и 2-го порядка, обнаруженные в этой группе пациентов, характеризовались слабой мембранозно-цитоплазматической экспрессией протеина Claudin 11 в 1-3 балла во всех наблюдениях (100%) данной группы. Среднее значение ИГХК для этих клеток сперматогенного эпителия составило 1,5 +0,17.

В эндотелиальных клетках перитубулярных гемокапилляров проявляли умеренную мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 (4-6 балла) в 8 случаях (66,7%), а в 4 случаях (33,7%) данной группы наблюдали слабую мембранозно-цитоплазматическую экспрессию протеина Claudin 11 в 1-3 балла. Среднее значение ИГХК равнялось 5,3 ± 0,42 балла. В группе больных с секреторным бесплодием с синдромом "только клетки Сертоли" (всего 5 пациентов) в клетках Сертоли наблюдали слабые мембранозно-цитоплазматические окраски протеина Claudin 11 в 1-3 балла в 2 наблюдениях (40%), в 3 случаях (60%) мембранозно-цитоплазматическая экспрессия протеина Claudin 11 в сустентоцитах отсутствовала (0 баллов). Среднее значение ИГХК составил 0,8 ± 0,6 балла.

В эндотелиальных клетках перитубулярных гемокапилляров наблюдали слабую мембранозно-цитоплазматичную экспрессию протеина Claudin 11 в 1 -3 балла в двух наблюдениях (40%) данной группы, в других 60% случаев экспрессия протеина Claudin 11 отсутствовала (0 баллов). Среднее значение ИГХК также равно 0,8 ± 0,6 балла.

Таким образом, установлено статистически достоверное снижение показателей ИГХК-экспрессии протеина Claudin 11 в клетках Сертоли и эндотелиальных клетках перитубулярный гемокапилляров в группах больных секреторным бесплодием с блоком сперматогенеза на уровне сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2-го порядка или сперматида и с синдромом "только клетки Сертоли" по сравнению с пациентами с экскреторно-обтурационным бесплодием.

Современными молекулярными исследованиями установлено, что протеины семейства claudins - это трансмембранные белки, которые являются важнейшим компонентом межклеточных плотных запирающих контактов, выполняющих барьерную функцию, образуя тканевые барьеры в различных органах. Кроме них, в составе плотных контактов оказываются трансмембранный протеин occludin, цитоплазматические белки zonula occludens (ZO-1, ZO-2, ZO-3) и junctional adhesion molecule (JAM), но в значительно в меньшем количестве. Итак, клаудины являются главным компонентом межклеточных плотных запирающих контактов, молекула клаудина имеет четыре трансмембранных домены, два внеклеточные и одну внутриклеточную петли и N-и С-концы, что располагаются в цитоплазме. У человека известны 24 члена этого семейства. Но, именно Claudin 11 экспрессирует в плотных контактах между клетками Сертоли. Это специфический для гематотестикулярного барьера протеин.

Выявленные в нашем исследовании особенности ИГХ-экспрессии протеина Claudin 11 характерных для различных форм мужского бесплодия, свидетельствуют о значительных нарушениях гематотестикулярного барьера в группах больных с секреторным бесплодием с блоком сперматогенеза на уровне сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2 - го порядка или сперматида и с синдромом "только клетки Сертоли" по сравнению с пациентами с экскреторно-обтурационным бесплодием. Учитывая важные функции, которые выполняет Claudin 11 в формировании целостности гематотестикулярного барьера, становится очевидным, что повреждения компонента этого барьера лежат в основе развития иммунного компонента и углубления патологических изменений ткани яичка при мужском бесплодии.

Сниженния уровня ИГХ-экспрессии протеина Claudin 11 при секреторной форме мужского бесплодия и синдроме "только клетки Сертоли" свидетельствует о значительных нарушениях гематотестикулярного барьера, которые являются основой развития дополнительного иммунного компонента и углубление патологических изменений ткани яичка у больных при этих формах мужского бесплодия.

При морфологическом исследовании биоптата яичка целесообразно определение ИГХК-экспрессии протеина Claudin 11 как информативного диагностического и прогностического показателя состояния гематотестикулярного барьера, который необходимо учитывать при диагностике и лечении мужского бесплодия.

С.В. Базалицкая
Государственное учреждение «Институт урологии НАМИ Украины», г. Киев