Аутологическая трансплантация жировой ткани (липофилинг) является распространенным методом коррекции контурных эстетических и косметических дефектов поверхностных мягких тканей.

Несмотря на преимущества данного метода, есть и недостатки, связанные, прежде всего, с рассасыванием трансплантированной ткани и ее последующим фиброзированием.

В научной литературе широко обсуждается возможность использования ММСК, выделенных из жировой ткани, для защиты трансплантата от тканевой резорбции. Однако, изучен вопрос о влиянии трансплантации аллогенных ММСК на процессы приживления и функционирования аутологической жировой ткани, если аутологический клеточный материал использовать для выделения и культивирования до необходимой действенной клеточной массы невозможно или есть потребность в быстром получении клеточного трансплантата.

Экспериментальное исследование проведено с использованием самок мышей линии FVB («дикий тип») и FVB-Cg-Tg (GFPU) 5Nagy /J (трансгенные по гену зеленого флуоресцентного белка - GFP), массой тела 25-30 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария. Эксперимент проведен с соблюдением требований биоэтики и норм биологической безопасности. Аллогенные ММСК получали путем клеточного культивирования из жировой ткани трансгенных по гену GFP мышей, изъятой из паховой области после эвтаназии.

Адипогенное дифференцирование осуществляли путем посева клеток в 6-луночный планшет в концентрации 5 х 10³/см². Через 24 ч. рабочую питательную среду заменяли на дифференциальную питательную среду, состоящее из DMEM-LG, 10% FBS, 1% антибиотика (цефтриаксон), 50 мкмоль индометацина, 1 мкмоль дексаметазона, 0,5 ммоль ИВМХ. Дифференциальное питательную среду заменяли через каждые 72 ч. в течение 28 суток.

В течение этого периода изучали изменения активности пролиферации клеток, их морфологии, отмечали интервалы изменений характеристик культуры. Фиксированный монослой клеток окрашивали с использованием Oil Red О и гематоксилин и эозин.

Гетеротропические трансплантации фрагментов подкожной жировой ткани у лабораторных мышей линии FVB осуществляли путем пересадки фрагмента жировой клетчатки с паховой области под кожу по обе стороны от позвоночника, формируя ложе для аутотрансплантатов.

Животным с одной стороны пересаживали клеточно-тканевой трансплантат, состоящий из аутологичной жировой ткани и аллогенного клеточного материала (из расчета 0,5 х 10⁶ клеток), с противоположной стороны - аутологичной материал, в который вводили аналогичный по объему изотонический раствор натрия хлорида. Через 14 и 28 дней эксперимента животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации предварительной наркотизацией парами эфира.

Выделенные трансплантаты жировой ткани взвешивали, промывали в 1 мл. изотонического раствора натрия хлорида и фиксировали для дальнейшего исследования в 4% растворе параформальдегид на фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) в течение 24 час.

Применяли гистологические, иммуногистохимические, морфометрические и статистические методы исследования.

Результаты исследования культуры клеток, выделенных из жировой ткани, свидетельствовали о преобладании клеток диаметром до 80 мкм., содержащих значительное количество вакуолей и гранул. Именно эти клетки имели фибробластоподобную структуру, характеризовались высокой адгезивностью, колониеобразованием, которые способны пролифировать в культуре более 72 раза. С целью определения возможности дифференцировки клеток в адипогенном направлении осуществляли направленную индукцию. При культивировании клеток в ангиогенной питательной среде в них образовывались липидные вакуоли, которые имели тенденцию к слиянию и образованию единого жирового включения, формируя "кольцо-печать", характерную для зрелых адипоцитов.

Ядро смещено к периферии, цитоплазма представлена ​​узким ободком, клетка приобретала шаровидную форму. Кроме того, в клетках накапливались нейтральные жиры, а сами клетки образовывали кластеры адипоцитов. Подобные морфологические превращения клеток свидетельствовали о вступлении характерных признаков жировой ткани - адипоцитов, что подтверждено окраской Oil Red О и гематоксилином. По данным морфометрического анализа, 75% клеток в культуре дифференцировались в адипогенном направлении.

Результаты эксперимента in vitro позволили перейти к второй части исследования, а именно определение возможности использования аллогенных ММСК жировой ткани для защиты пересаженного жирового трансплантата от тканевой резорбции. Через 2 недели после гетеротопической аутологичной трансплантации фрагментов жировой ткани вместе ММСК наблюдали достоверно (Р = 0,05) меньше дефицит массы клеточно-тканевого трансплантата по сравнению с таким, в которое не трансплантировали ММСК.

На 4-й неделе после пересадки наблюдали противоположную тенденцию: дефицит массы тканево-клеточного и тканевого трансплантатов составлял соответственно (55,0 ± 22,1) и (33,6 ± 21,2)% (Р = 0,05). По данным проведенного в 2-й неделе эксперимента гистологического исследования фрагментов трансплантатов как клеточно-тканевых, так и с введенным изотоническим раствором натрия хлорида, проявляли участки лизиса адипоцитов, отек периваскулярного пространства и лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация.

На 4-й неделе в биоптатах отмечали участки фибриноидного некроза, кальцификации, сладж эритроцитов, гиалиноз стенки сосудов.

Участки некроза и инфильтрационный отек жировой ткани более выражены в клеточно-тканевых трансплантатов, чем в тканевых.

По данным морфометрического анализа, при введении в жировую ткань ММСК наблюдалась тенденция к увеличению интенсивности некроза адипоцитов по сравнению с таковой при введении изотонического раствора натрия хлорида. Интенсификацию некроза адипоцитов (почти в 3 раза) в жировых трансплантатов отмечали на 2-4-й неделе после гетеротопической пересадки.

Вероятно, гетеротопическая трансплантация фрагментов жировой ткани вместе с ММСК обусловливает интенсификацию воспалительного процесса, некроз адипоцитов, что способствует ускорению формирования деструктивных процессов в трансплантат.

В клеточно-тканевом трансплантате уже к 2-й недели эксперимента наблюдали дегенеративно-дистрофические процессы, которые обусловили накопление внеклеточной воспалительной жидкости и ошибочно положительную стабилизацию массы трансплантата. В тканевом трансплантате процессы резорбции начинаются более активно, без инфильтративно-воспалительного периода, что приводит постепенную и стабильную потерю массы трансплантата

На 4-й неделе процессы тканевой резорбции постепенно стабилизируются, а в тканево-клеточном трансплантате - активно продолжаются вследствие деструкции адипоцитов и потери внеклеточной жидкости. Кроме того, можно предположить формирование иммунного ответа на антигены ММСК, или продукты секреции или распада этих клеток стимулируют макрофимгальнолимфоцитарную инфильтрацию.

На 2-й и 4-й неделе после гетеротопической пересадки клеточно-тканевого трансплантата по данным иммуногистохимического исследования в биоптате проявляли трансплантированные ММСК, количество которых на 4-й неделе эксперимента достоверно увеличивалась (Р <0,05), стволовые клетки содержались преимущественно в стенках мелких сосудов, что позволяет предположить эндотелиальный направление дифференцировки клеток и свидетельствует об отсутствии отторжение клеточного материала. Аллогенные ММСК, трансплантированные совместно с жировой тканью, способны к миграции. По данным иммуногистохимического исследования в контралатеральной жировом трансплантате, в который вводили изотонический раствор натрия хлорида, обнаружены донорские ММСК.

Клетки, которые мигрировали, локализовались преимущественно в стенках мелких и среднего диаметра сосудов.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что клетки, выделенные из жировой ткани, способны in vitro к дифференцировке в адипогенном, a in vivo - в эндотелиальном направления, открывает значительные перспективы их использования в регенераторно-восстановительной медицине. Однако, пересадки аллогенных ММСК для защиты жирового трансплантата от тканевой резорбции не достигает поставленной цели. Введение в жировой трансплантат аллогенных ММСК вызывает усиление процессов воспаления, некроз адипоцитов, и, как следствие, усиление тканевой резорбции и дефицит массы трансплантата.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших экспериментальных исследований и исследования течения репаративных процессов в пересаженном клеточно-тканном трансплантате только аутологичного происхождения.

После проведенного исследования стало ясно, что клетки, выделенные из жировой ткани, способны к дифференцировке в адипогенное направление при условии культивирования в индукционной среде. Совместное пересадки жировой трансплантата и ММСК, выделенных из аллогенной жировой ткани, вызывает активацию в нем деструктивно - воспалительных процессов, ухудшения выживаемости адипоцитов и в дальнейшем - значительный дефицит массы трансплантата.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о нецелесообразности использования в клинической практике клеточно-тканевого трансплантата, состоящего из аллогенного донорского материала и аутологической жировой ткани.

Ю. В. Поляченко, К.М. Запольска, Р.В. Салюты, А. В. Кучук, В.М. Кирик,
П. П. Клименко, Г. М. Онищенко, В. А. Шаблий
Национальный институт хирургии и трансплантологии имени А. А. Шалимова НАМИ Украины, г. Киев,
Институт генетической и регенеративной медицины НАМИ Украины, г. Киев,
Координационный центр трансплантации органов, тканей и клеток Минздрава Украины, Институт клеточной терапии, г. Киев