Спасибо, ваше сообщение принято.

Наши менеджеры обработают его
и свяжутся с Вами максимально быстро.

Корзина пуста

Молекулярно-генетические аспекты диагностики онкогематологической патологии
17.05.2013

Молекулярно-генетические аспекты диагностики онкогематологической патологии

Значительный прогресс в области молекулярно-генетической диагностики онкогематологической патологии открыл новые перспективы в расшифровке молекулярных механизмов канцерогенеза, разработке стратегии и тактики лечения и повышении его эффективности.

Успехи в этом направлении позволили идентифицировать конкретные молекулярно-генетические аномалии не только в остром периоде заболевания, но и выявлять окончательный пул опухолевых клеток в стадии клинической ремиссии, то есть определять минимальную резидуальную болезнь. Данные о наличии опухолевого клона позволяют определить степень злокачественности и стадию развития опухолевого процесса, что позволяет отнести пациента к той или иной группе риска и, следовательно, определяет выбор тактики лечения.

Молекулярно-генетические аспекты канцерогенеза

Одной из основных задач современной гематологии является раскрытие механизмов становления и развития лейкемического процесса.

В настоящее время среди теорий канцерогенеза ведущее место занимает молекулярно-генетическая теория, согласно которой в основе злокачественной трансформации лежат структурно-функциональные изменения клеточных генов, что влечет за собой нарушение функции белков, участвующих в контроле клеточной пролиферации, дифференцировки и гибели. Результатом этих изменений является появление клона клеток с неконтролируемым ростом, пролиферация которого и приводит к возникновению опухоли. Именно на молекулярном уровне были получены доказательства общности механизма возникновения опухолей вирусного и невирусного происхождения путем активации или подавления идентичных генов.

Существуют различные схемы лейкемогенеза, отражающие последовательность молекулярных событий, приводящих к возникновению опухоли. Для острых лейкемий (ОЛ) предложена модель «генетического груза»: развитию опухоли предшествует накопление в геноме мутаций, повышающих пролиферативный потенциал клетки и/или блокирующих механизмы апоптоза. Этот «генетический груз» может неопределенно долгое время компенсироваться функционированием системы генов-супрессоров опухолевого роста. Последующие мутации в генах-супрессорах или делеции интактньих аллелей протоонкогенов приводят к интенсивной пролиферации бластов.

Кроме того, накапливающиеся в геноме нарушения могут повлечь за собой качественные изменения в молекулярных механизмах регуляции основных процессов, происходящих в клетке, что также может привести к индукции опухолевого роста. Малигнизация нормальной клетки является результатом каскадного накопления определенных изменений в ее генетическом материале. Нарушения в структуре генов могут происходить без видимых действий. Каждую секунду в организме человека происходит деление около 25 милионов клеток. Этот процесс находится под строгим контролем, осуществляемым комплексом молекулярных систем в определенных органах и в точное время. Все возникающие нарушения фиксируются и устраняются системами репарации клеточного генома. Однако в некоторых случаях восстановление нормальной структуры измененного гена может не состояться, кодируемый белковый продукт и его свойства изменяются. Если эта аномалия имеет принципиальный характер и затрагивает ключевые гены (потенциальные онкогены), то будет становиться возможной трансформация клетки.

В начале 80-х годов были открыты две основные группы генов (протоонкогены и гены-супрессоры), повреждения в которых являются ключевыми в процессе малигнизации клетки. К генетическим детерминантам клетки, вовлеченным в канцерогенез, относятся, прежде всего, протоонкогены. В случае структурных изменений или повышении уровня экспрессии протоонкогенов нарушается контроль нормального клеточного роста и дифференцировки, что приводит к трансформации клетки.

Пути превращения протоонкогенов в онкогены различны. Это может быть генная амплификация – увеличение количества транскрибируемого продукта, точечные мутации в структурной части гена, хромосомные транслокации, активация за счет встраивания вблизи протоонкогена эндогенного или экзогенного промотора или инхансера, а также нарушение регуляции транскрипции, трансляции.

Появление специфических транслокаций является наиболее часто встречающимся генетическим изменением, приводящим к объединению генов, которые в здоровых клетках расположены в разных участках генома. В результате образуются новые химерные, или гибридные, гены. Это вызывает либо суперэкспрессию протоонкогенов, либо экспрессию химерных белков, обладающих онкогенными свойствами. Чаще всего гены, вовлекаемые в подобные перестройки, кодируют факторы транскрипции, регуляторы клеточного цикла, рецепторы, иммуноглобулины, молекулы Т-клеточного рецептора. Одними из первых были описаны специфические лейкоз-ассоциированные объединенные гены ВСR/АВL, их химерная мРНК и белок р210, обладающий онкогенными свойствами. Цитогенетическое нарушение, присутствующее у 85-90 % пациентов с хронической миелобластной лейкемией (ХМЛ), на молекулярном уровне представляет собой транслокацию с-abl протоонкогена с 9-й хромосомы на 22-ю хромосому в участок bcr, образуя химерный ген bcr/аbl. Этот ген экспрессирует фосфопротеин, который отличается от нормального своей молекулярной массой и уровнем проявляемой тирозинкиназной активности, что играет важную роль в патогенезе ХМЛ. ВСR/АВL-комплекс является маркером ХМЛ, поэтому его определение используется не только для ранней диагностики, но и для мониторирования лейкемического процесса, в частности оценки полноты ремиссии, а также при определении минимальной резидуальной болезни (МRD) после ТКМ.

У 25 % пациентов с острыми миелоидными лейкемиями (ОМЛ) обнаруживаются точковые мутации гена ras. У большинства из них ген N-ras мутирован либо в 13, либо в 61 кодоне. Мутированный вариант данного гена часто обнаруживается при миелодиспластических синдромах и коррелирует с прогрессией лейкемического процесса. В отдельных случаях острой лимфобластной лейкемии (ОЛЛ) также обнаруживается мутация гена ras.

Показательны наблюдения и при острой промиелоцитарной лейкемии, когда ген рецептора ретиноевой кислоты (RАR) объединяется с другим геном и образуется лейкозассоциированный химерный ген RАR/PМL, кодирующий белок с онкогенными свойствами. Отсутствие данного химерного гена считают причиной резистентности к действию препаратов ретиноевой кислоты.

При лимфоме Беркитта характерно появление транслокации t, в которой участвует 8 хромосома на уровне сегмента q24, где расположен протоонкоген с-myc. В результате транслокации протоонкоген с-myc встраивается на хромосому 14 на уровне сегмента q32, где расположен локус гена тяжелой цепи иммуноглобулина IgН. В результате регуляторный элемент гена IgН усиливает транскрибционную активность с-myc. Продуктом с-myc гена является ДНК-связанный белок, который причастен к процессу репликации ДНК. Таким образом, суперэкспрессия с-myc может вести к неограниченной пролиферации клеток, несущих подобную транслокацию.

Различны не только механизмы активации различных групп протоонкогенов, но и этиологические факторы, запускающие процесс. К таким факторам можно отнести физические, химические и биологические канцерогены, а также эндогенные факторы (несостоятельность иммунной системы, гормональный дисбаланс, хромосомная нестабильность и другие). Возможно и прямое воздействие, например, посредством вирусов, содержащих онкогены (вирусы Т-клеточного лейкоза/лимфомы  НTLV-I, волосатоклеточного лейкоза  НТLV-II, вирус Эпштейна-Барра, связанного с развитием лимфомы Беркитта, высокозлокачественных неходжкинских лимфом).

Принципиальное отличие онкогенов от генов-супрессоров заключается в том, что онкогены активизируются за счет генетических изменений не в половых, а в соматических клетках-мишенях того или иного органа, и, следовательно, онкогенные мутации не наследуются.

Активация протоонкогена имеет доминантный характер, то есть для индуцирования злокачественного перерождения клетки достаточно изменения в одном из двух аллелей данного гена.

Известны генетические перестройки, сопровождающиеся переносом протоонкогена в область генов иммуноглобулина (1g) или генов рецептора Т-лимфоцитов (ТСR). Данные аберрации, характерные для зрелой В- и Т-клеточной ОЛЛ, приводят к состыковке кодирующих последовательностей протоонкогена с сильными промоторами генов ТСR или Ig, следствием чего является повышение уровня экспрессии протоонкогена.

Многие протоонкогены располагаются в участках хромосом, претерпевающих неслучайные изменения при злокачественных новообразованиях. Оказалось, что ранние перестройки хромосом являются важным условием для активации латентных онкогенов генома при их транспозиции в новое генетическое окружение. Так, наблюдавшиеся при лейкемиях нарушения в хромосомах 6, 8, 9, 15, 17, 20, 22 интересны с той точки зрения, что именно в этих хромосомах локализуются клеточные протоонкогены, которым отводится значительная роль в процессах малигнизации. Отмеченные в ряде случаев моносомии или трисомии этих хромосом также могут играть определенную роль в малигнизации вследствие изменения соотношения нормальных и мутировавших онкогенов в клетке. Возможно, что при трисомиях появляются дополнительные копии генов и увеличивается доза активированного онкогена – онкоген многократно реплицируется и в клетке оказывается увеличенным число его копий, что ведет как к малигнизации, так и к прогрессии.

Вторую группу генов, принимающих участие в канцерогенезе, представляют гены-супрессоры опухоли, потеря которых приводит к отмене подавления клеточной пролиферации. Наиболее изученным геном-супрессором является ген р53. Изменения в р53 наблюдаются более чем в половине всех опухолей человека.

Мутации, инактивирующие ген-супрессор, в отличие от онкогенов, имеют рецессивный характер проявления – для трансформации клетки необходима инактивация обоих аллелей гена.

Таким образом, по современным представлениям, злокачественная трансформация гемопоэтической клетки происходит в результате структурно-функциональных изменений клеточных генов, детерминирующих возникновение и прогрессию опухолевого процесса (протоонкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста). Эти генетические изменения являются многостадийными и затрагивают несколько различных генов. Следует отметить, что многообразие механизмов канцерогенеза не ограничивается нарушениями протоонкогенов и генов-супрессоров опухоли.

Современные методы исследования генетических нарушений

С начала 70-х годов прошлого столетия для раскрытия генетических механизмов канцерогенеза используются методы дифференциального окрашивания прометафазных и метафазных хромосом.

Наиболее распространенным является G-метод дифференциального окрашивания хромосом красителем Гимза, при котором каждая пара хромосом приобретает поперечную исчерченность по длине. Дифференциальная окраска обеспечивается наличием темных (гетерохроматиновых) и светлых (эухроматиновых) сегментов, индивидуальных для каждой хромосомы. Это изображение содержит в общей сложности 350-400 сегментов на гаплотип (не менее 320).

На основании G-метода можно судить о состоянии всего генома в конкретной клетке; изменении количества хромосом; нарушении целостности хромосом; переносе генетического материала с одной хромосомы на другую. Это дает возможность обзорно оценить состояние всего генома клетки, обнаружить крупные транслокации, умножение или утрату хромосомного материала, которые специфичны для того или иного вида лейкемий.

В тех случаях, когда аномальный кариотип обнаруживается во всех исследуемых клетках костного мозга, необходимо провести цитогенетическое исследование клеток других тканей с целью верификации конститутивного нормального кариотипа. Это обусловлено тем, что некоторые количественные хромосомные аномалии или перестройки, наблюдаемые в злокачественных клетках, могут быть описаны как конститутивные нарушения: трисомия 8 и 21, потеря половой хромосомы, транслокация t: (11; 22) (q23; q11). В большинстве случаев клетки здоровых тканей будут иметь нормальный кариотип, а нарушения в злокачественных клетках – это соматические мутации на фоне нормального кариотипа.

Хромосомные аномалии, в определенной степени сопряженные с вариантом острого лейкоза, включены в МІС-классификацию ОЛ.

Однако на сегодняшний день использование только G-метода дифференциальной окраски хромосом не позволяет получить полную информацию о состоянии генетического материала. Это связано с тем, что структурные перестройки могут быть намного меньше, чем сегменты, получаемые при дифференциальной окраске, и, следовательно, они не обнаруживаются методом G-banding; изменения около 106-107 пар оснований могут происходить без видимого изменения морфологии хромосом. Кроме того, остаются недоступными для анализа неделящиеся клетки, часть из которых может быть популяцией опухолевых клеток; клетки пациентов с онкогематологичсекими заболеваниями плохо культивируются in vitro, поэтому не всегда удается получить качественные препараты метафазных пластинок, а, следовательно, большая часть патологических клеток не поддается анализу. Несмотря на то, что наличие или отсутствие клеток с нормальным кариотипом имеет прогностическое значение, соотношение нормальных и аномальных клеток зависит от условий культивирования и ошибок забора генетического материала для исследования. И, наконец, методика G-окраски хромосом продолжительна во времени, что затрудняет быстрое получение результата для своевременной диагностики и выбора стратегии и тактики ведения больного.

В настоящее время для выявления генетических изменений, происходящих на молекулярном уровне, цитогенетические исследования дополняют методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) и методом полимеразной цепной реакции (РСR).

Молекулярно-генетический метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с локус-специфичнами зондами позволил упростить идентификацию как целых хромосом, так и отдельных участков генома. По сравнению с традиционным цитогенетическим методом дифференциального окрашивания хромосом, FISH-анализ имеет ряд значительных преимуществ: позволяет оценить структурную целостность последовательности минимум в 1000 пар оснований; дает возможность проводить исследования без предварительного культивирования клеток in vitro, используя неделящиеся интерфазные клетки. Кроме того, позволяет анализировать множественные изменения в клетках, которые могут быть связаны с опухолевой прогрессией. FISH-анализ позволяет количественно оценить генетические нарушения, что дает возможность оценить в динамике процесс эррадикации опухолевого клона.

Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) с ДНК-зондами представляет собой ряд последовательных преобразований ДНК исследуемой клетки. При этом ДНК в клетках-мишенях денатурируется и вступает в реакцию с зондом. ДНК-зонд представляет собой олигонуклеотид с последовательностью пар оснований, комплементарной к исследуемому участку хромосомы. В зависимости от того, какая часть хромосомы метится зондом, выделяют общехромосомные, центромерные и локус-специфичные зонды. Зонд связывается только с той частью ДНК, для которой эта последовательность оснований комплементарна. Основная часть ДНК флюоресцирует в спектре, который отличается от спектра меченной зондом ДНК.

В онкогематологической практике, как правило, используют PISH-анализ с локус-специфичными ДНК-зондами, которые позволяют метить специфичные геномные локусы, например, гены-супрессоры или протоонкогены, генетические изменения в которых играют основную роль в инициации опухоли или прогрессировании заболевания.

На сегодняшний день большинство локус-специфичных зондов можно использовать как на метафазных пластинках, так и на интерфазных клетках. Использование FISH в интерфазных клетках удобно при обработке замороженных, зафиксированных, редко делящихся и вообще не делящихся клеток. Это имеет важное диагностическое значение, так как клетки делящейся популяции могут иметь неопухолевое происхождение.

Метод получил наиболее широкое применение для анализа известных количественных нарушений в опухолевых клетках. При этом результаты FISH-анализа оказываются более информативными, чем данные, полученные при использовании других методов. Так, из 340 пациентов с ХЛЛ рутинными цитогенетическими методами было выявлено 31 случай (9 %) с трисомией 12, а при использовании FISH с центромерным зондом  68 случаев (20 %).

Расшифровка нуклеотидных последовательностей генов, участвующих в процессах лейкемогенеза, позволила применять для диагностики генетических нарушений опухолевого клона метод полимеразной цепной реакции (РСR), основанный на многократной амплификации известной нуклеотидной последовательности и последующей детекции полученного материала с помощью электрофореза.

ПЦР-исследование лейкозо-специфичных химерных генов, образовавшихся в результате хромосомных аберраций, основано на использовании олигонуклеотидных праймеров, ограничивающих участки разрывов химерных генов таким образом, чтобы получаемый ПЦР-продукт содержал опухоль-специфичную химерную последовательность. В качестве матрицы для ПЦР может быть использована как геномная ДНК, так и комплементарная ДНК (кДНК), полученная в результате обратной транскрипции с матричной РНК (мРНК).

Для повышения чувствительности и специфичности реакции используют метод «гнездной» (nested) ПЦР. При этом проводят две последовательные амплификации фрагментов-мишеней. Продукт первой амплификации является матрицей для второй амплификации. Во второй амплификации используют так называемые «внутренние» праймеры, которые более узко ограничивают исследуемый участок. «Гнездная» ПЦР позволяет увеличить разрешающую способность метода, а также минимизировать количество неспецифических фрагментов амплификации.

ПЦР отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Из всех предложенных методов он является наиболее точным с максимальной разрешающей способностью. Например, при ОЛЛ у детей в возрасте от 2 до 9 лет наличие транслокации цитогенетическим методом выявляется лишь в 0.05 % случаев, а при использовании РСR ее частота достигает 19-27 %. ПЦР позволяет обнаружить 1 опухолевую клетку из 104-106 нормальных клеток. При этом появляется возможность обнаружить мутацию на уровне 1 нуклеотида, то есть выявляется не просто ген, а различные мутации внутри гена, каждая из которых может иметь разное прогностическое значение.

Высокая чувствительность и специфичность молекулярно-генетических методов обеспечивают не только надежное выявление генетических аномалий в остром периоде заболевания, но и индикацию остаточного пула опухолевых клеток в стадии ремиссии.

Следует отметить, что метод ПЦР имеет ряд особенностей, ограничивающих область его применения: для постановки методики обязательно должна быть известна нуклеотидная последовательность анализируемого участка; результат исследования содержит информацию только о строго ограниченном участке генома; метод является качественным и не дает возможность оценить частоту полученных изменений, а значит, их динамику во времени.

Современные цитогенетические и молекулярно-генетические методы направлены на исследование структурно-функциональных нарушений генома на хромосомном и молекулярном уровнях. Они не взаимоисключающие, а лишь частично перекрывающие и дополняющие друг друга. При этом в зависимости от решаемой задачи меняется объем проводимых исследований.

Таким образом, для получения объективных данных о структурно-функциональных изменениях генетического материала у онкогематологических больных необходим комплексный цитогенетический и молекулярногенетический подход с адекватным выбором методов исследования и взаимодополнением одного метода другим.

Применение цитогенетических и молекулярногенетических методов для исследования нарушений генома у лиц с онкогематологической патологией позволяет осуществить исследование химеризма по половым хромосомам после проведения трансплантации костного мозга (ТКМ) с целью контроля приживляемости трансплантанта. Кроме того, эти методы позволяют также осуществлять молекулярно-генетический мониторинг специфических маркеров опухолевых клеток после проведения ТКМ для контроля эрадикации опухолевого клона и выявления минимальной резидуальной болезни.

В настоящее время, когда молекулярные технологии стремительно развиваются, возможности ПЦР не ограничиваются только диагностическим подходом. Все чаще ПЦР является только первой ступенью в генетических исследованиях.

Совершенствование методов исследования приводит к появлению новых путей в поиске маркеров, позволяющих оценить динамику лейкемического процесса, а также провести прогноз его течения. Перспективными являются исследования взаимосвязи между особенностями метилирования ДНК и вариантом лейкемии, а также стадией заболевания. Установлено, что гиперметилирование гена кальцитонина может служить маркером персистирования опухолевого клона и (или) повышения его активности и, следовательно, неблагоприятного прогноза. При этом высказывается предположение, что реверсия нормальной картины метилирования 5'-областей гена кальцитонина на патологию происходит задолго до появления клиникоморфологических признаков рецидива заболевания.

Имя: *
Е-mail: *
Отзыв: *
Код защиты: * Сменить код
* - поля, обязательные для заполнения
Статьи
Гематология
Молекулярно-генетические аспекты диагностики онког
Молекулярно-генетические аспекты диагностики онког...
Значительный прогресс в области молекулярно-генетической диагностики о...
Стоматология
Какая зубная паста лучше?
Какая зубная паста лучше?...
Тот человек, который считает все зубные пасты одинаковыми, наверняка и...
Болезни ЖКТ
Коварный аппендицит: как распознать и предупредить
Коварный аппендицит: как распознать и предупредить...
Среди населения бытует крайне вредная точка зрения, что аппендицит - л...
Новые медицинские учреждения
  • Интернет-магазин
  • SKYDENT
  • «Аксимед» — Клиника современной неврологии
  • Студия красоты и развития
  • Алтес - Сумы
  • Мед Люкс Детокс
  • DietCenter
  • Лико-Мед
  • Сучасна стоматологія Денітка- Луцьк