Спасибо, ваше сообщение принято.

Наши менеджеры обработают его
и свяжутся с Вами максимально быстро.

Корзина пуста

Влияние культивированных хондроцитов на рецепторный хондрогенез при имплантации в травматический дефект суставного хряща (экспериментальное исследование)
11.05.2013

Влияние культивированных хондроцитов на рецепторный хондрогенез при имплантации в травматический дефект суставного хряща (экспериментальное исследование)

На сегодня разрабатывается ряд методов лечения эффектов суставного хряща с применением культивированных аутологических или аллогенных клеток. Однако перед широким внедрением нового метода, подключают носители (scaffolds), клетки с различных тканевых ресурсов, ткани и биологически активные факторы, биобезопасность и эффективность их применения должна быть продемонстирована как в доклинических исследованиях, базирующихся на релевантных животных моделях, так и в последующих клинических испытаниях новой клеточной терапии. Каждая новая терапия взрослых пациентов должна быть проверена на экспериментальных животных, достигших зрелости скелета и суставного хряща. Самое большое преимущество экспериментальных исследований с использованием животных состоит в возможности контроля размера и глубины повреждения, топологии дефекта и продолжительности эксперимента.

Гистологические данные используются для установления наличия импланта в области дефекта, сравнения и оценки в динамике особенностей формирования суставного хряща при применении различных клеточных культур и носителей.

Изоляция и культивирование хондроцитов суставного хряща

Изоляцию хондроцитов суставного хряща собаки (п = 4, Мm = 3,0 .) проводили по общепринятым методикам. То есть, для ферментативного дезагрегирования тканевого биоптата использовали 0,2% раствор коллагеназы ІА (Sigma, США).

КОЕ-анализ (колониеобразующих единиц)

Процесс колониеобразования исследуемого типа клеток изучали путем посева 102 клеток на чашку Петри в ростовой среде, содержащей DMEM/F12, 1:1 (Sigma, США).

Кинетика роста клеточных популяций культивируемых хондроцитов

Число клеточных удвоений (n) и время удвоения клеточной популяции (t) при условии, что последняя находится в фазе логарифмического роста в пределах стандартной кривой роста клеточной популяции.

Изготовление клеточного носителя на основе агарозного гидрогеля и культивируемых хондроцитов

Для приготовления 2% агарозного гидрогеля с первичными культивируемым хондроцитами в аллогенных варианте использовали агарозу с показателями прочности для 1% гидрогеля> 1200 г/см2 и точкой гелеобразования 36,0 +1,5 ° С (Sigma, США) и питательную среду DMEM-HG (с 4,5 г / л. глюкозы, РАА, Германия).

Моделирование остеохондриальных дефектов у животных

Эксперименты на животных проводили согласно требованиям "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes" (Strasbourg, 18.03.1986, ratification date 01.01.1991, CETS № 123) и положениями заключительного документа по "Общих этических принципов экспериментов на животных", принятом на первом национальном конгрессе по биоэтике (Киев, Украина, 17-20 сентября 2001 p.).

Экспериментальное исследование выполнено на 8 непосредственно природных взрослых собаках со средней начальной массой тела 15,3 ± 2,1 кг., в которых хирургически под кетаминовым наркозом после артротомии коленного сустава на участке поднадколенковои борозды правой бедренной кости получали сверлом диаметром 3 мм. травматический остеохондральный дефект, глубиной 5 мм..

  • В основную группу опыта вошли собаки (4 животных), которым после кюретажа дна и стенок в костно-хрещевой дефект имплантировали по типу аппликации агарозный гидрогелес с культивируемыми хондроцитами и рану суставной капсулы зашивали.
  • В контрольную группу опыта вошли собаки (4 животных), в которых получали аналогичный по технологии и топологии индуистический дефект, как и в основной группе опыта, но без имплантации культивированных хондроцитов.

После операции животных содержали в обычных условиях вивария. Операционный период протекал без осложнений. Все животные нагружали оперированную конечность уже с первого-второго дня после хирургического вмешательства. За 3 мес. после хирургического вмешательства у животных под кетаминовым наркозом в стерильных условиях артроскопически получали биоптаты из области оперативного дефекта. Взятый биопсийный материал фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН = 7, 6), декальцинировали в 5% азотной кислоте и после обезжиривания и обезвоживания в ацетоне и спиртах нарастающей прочности заливали в парафиновые блоки. Гистологические срезы толщиной 10-15 мкм., окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону.

Визуализация клеточных культур с использованием методов микроскопии

Визуализацию с использованием световой и фазово-контрастной микроскопий и фотодокументирование культур клеток проводили с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 40С, морфометрических программы по обработке изображения AxioVision Rel. 4.8 камеры AxioCam ERc 5s (Karl Zeiss, Германия). Клеточные препараты и культуры микроскировалы при 40 -, 100 -, 200 - и 320-кратном увеличении.

Методы статистической обработки результатов

Количественные характеристики случайных величин представленные в виде средних значений и стандартных погрешностей средних значений. Значимость различий показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.

Изоляция и культивирования аллогенных хондроцитов суставного хряща

Культура хондроцитов

Апробировано и оптимизировано методику изоляции хондроцитов суставного хряща собаки с помощью ферментативного метода. Изоляция коллагеназой ИА оказалась эффективной при концентрации 0,2% и времени ферментации 60 мин..

Полученные культуры хондроцитов субкультивировалы к третьему пассаже, что было достаточно для получения терапевтически значимого количества клеток (107/мл. носителя), и хранили в жидком азоте. Культивировали хондроциты при стандартных условиях с применением ростовой среды, содержащей DMEM/F12 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Максимальный коэффициент пассерование, при условии получения культур клеток, активно пролиферируют, составлял 1:10.

КОЕ-анализ

Формирование колоний на чашках Петри при низких посевных концентрациях клеток (например 102 клеток на чашку Петри), или, другими словами, определение эффективности посева (РЕ,%), является предпочтительным методом анализа пролиферации клеток в культуре и их выживаемости.

Такой подход демонстрирует разницу в скорости роста культуры в пределах популяции и обнаруживает разницу в изменении скорости роста (размер колонии) и выживаемости клеток число колоний). При посеве клеточной суспензии в чашках Петри в низкой концентрации клетки пролиферируют и формируют дискретные колонии. Число этих колоний может быть использовано для оценки эффективности культивирования выбранного типа клеток.

Кинетика роста культивируемых хондроцитов

Важнейшими параметрами оценки эффективности выращивания клеток in vitro являются такие параметры кинетики роста, как число клеточных удвоений в популяции и время удвоения клеточной популяции при условии, что последняя находится в фазе логарифмического роста в пределах стандартной кривой роста клеточной популяции.

По нашим расчетам, число клеточных удвоений, или количество случаев репликации (n), в популяциях хондроцитов течение трех пассажей составляло в среднем 4,4. Время удвоения клеточной популяции хондроцитов - это время, в течение которого происходит удвоение численности или массы популяции (t), составил в среднем 35 час..

Изготовление агарозного гидрогеля как трехмерного носителя культивируемых хондроцитов

Приготовленный в асептических условиях 4% жидкий раствор агарозы с температурой 37 ° С в питательной среде DMEM-HG быстро и тщательно смешивали 1:1 с суспензией культивируемых хондроцитов третьего пассажа и разливали по лункам 24-луночных плашки к полимеризации. В результате получали полимерный при комнатной температуре 2% агарозном гидрогель с концентрацией 107 клеток / мл/ лунку. Полимерный гидрогель с клетками в лунках заливали по 1 мл. питательной среды DMEM-HG и культивировали в СО2-инкубаторы при температуре 37 °С в течение 14 суток с полной сменой ростовой среды два раза в неделю. В дальнейшем клетки изолировали из агарозного гидрогеля с помощью 0,02% раствора ЭДТА (раствор версена) и оценивали их жизнеспособность методом окрашивания трипановым синим, который составляет 94%.

Влияние имплантированных в носителе хондроцитов на ход хондрогенеза при моделировании костно-хрящевых дефектов

Гистологически в суставных концах костей коленного сустава животных обеих опытных групп за 90 дней после хирургического вмешательства проявляли более или менее выраженные патологические изменения, топографически отражая сочетание дистрофических, некротических и репаративных-замещающих процессов.

В наблюдениях с получением остеохондрального дефекта без последующей имплантации агарозного гидрогеля с культивируемыми хондроцитами (контрольная группа животных) на суставной поверхности поднадколенковои борозды бедренной кости наблюдали изменения, отвечавшие гистологической картине гонартроза:

  • суставной хрящ неравномерно изящный;
  • выраженная дистрофия и разволокнение хрящевого матрикса;
  • умеренная деформация поверхностной зоны суставного хряща с развитием тонкого слоя фиброзного паннуса.

Остеохондриальный дефект у животных этой группы только частично был заполнен новообразованной фиброзной соединительной тканью, которая содержала участки хондроидноподобных клеток и, иногда, и костные перекладины. Формирование подхрящевой костной пластинки на участке дефекта не наблюдали. Поскольку деструкция, замещения и пролиферация хондроцитов выражены слабо и проходят неравномерно, они только частично обеспечивают замещение разрушенного суставного хряща.

В условиях имплантации в остеохондральный дефект агарозного гидрогеля с культивируемыми хондроцитами репаративный хондрогенез перебегал более активно. Дефекты суставных поверхностей заполнялись полностью преимущественно хондроидным, меньше фиброзным регенератом, покрытым со стороны суставной полости тонким слоем фиброзной соединительной ткани. Наблюдали тесную интеграцию вновь тканей регенерата с тканевой структурой суставного хряща краев дефекта. В суставном хряще вокруг дефекта проявляли более или менее выраженные явления дегенеративно-деструктивных изменений, преимущественно его поверхностной и промежуточных зон, и образование многоклеточных кластеров (пролифератив), что свойственно процессу неполноценной репаративной регенерации суставного хряща.

Итак, имплантация культивированных аллогенных хондроцитов в агарозном гидрогели (107клеток / мл. гидрогеля) в условиях этого эксперимента не привела к значительной оптимизации репаративного востановленния суставного хряща в срок наблюдения (3 мес.): в дефекте формировался регенерат предпочтительно за счет хондроидной ткани, содержащей участки фиброзной ткани, полностью заполняли дефект, вокруг которого наблюдали более или менее обширные участки деструкции суставного хряща и гиперцелюлярные кластеры, поверхность регенерата со стороны суставной полости была покрыта тонким слоем соединительнотканного паннуса. Четко определялась интеграция регенерата и прилегающих краев дефекта суставного хряща.  Одержанные нами данные совпадают с выводами ICRS (International Cartilage Repair Society) Recommendation Pipers, согласно которым для этого срока наблюдения (3 мес.) у крупных животных, к которым относятся и собаки, характерными признаками регенерата, что формируется, является его незрелость, наличие участков хондроидной ткани, содержащей ячейки фиброзной соединительной ткани и фиброзного хряща. Кроме того, следует считать, что биопсия в раннее сроки (первые сутки-третий месяц) может быть полезной для изучения процессов преобразования имплантата, формирования и интеграции регенерата с ткани-Н.И: участки дефекта, определение механизмов и причин неудачной имплантации и взаимодействующих факторов, способствующих или мешающих процессам восстановления поврежденного суставного хряща.

Выводы

1. Предложенная технология ферментативной изоляции хондроцитов позволяет получить из 3,0 г. суставного хряща 5,3 * 106 клеток. Трехкратное пассирование хондроцитов позволяет нарастить терапевтически значимое количество пролиферирующих клеток (107 клеток / мл. гидрогеля) без тенденции к их дедифференцированнию в фибробластоидные клетки.

2. Методика изготовления трехмерного носителя культивируемых хондроцитов на основе 2% агарозного гидрогеля обеспечивает в 94% жизнеспособность хондроцитов при культивировании в гидрогели течение 14 суток.

3. Эффективность посева изолированных хондроцитов суставного хряща после третьего пассажа, по данным КОЕ-анализа, составляет 44%. Число клеточных удвоений хондроцитов течение трех пассажей (в среднем n = 4,4) и время удвоения клеточной популяции хондроцитов (в среднем t = 35,3 ч.) свидетельствуют об оптимальной кинетике роста клеточной популяции.

4. Патогистологические исследования биоптатов, взятых у животных с участка дефекта суставного хряща поднадколенной борозды за 3 мес. после нанесения травмы, которым имплантировали агарозный гидрогель с культивируемыми хондроцитами обнаружили частичное заполнение остеохондриального дефекта преимущественно фиброзного регенерата. Патоморфологические изменения суставного хряща на участке дефекта отвечали дегенеративно-дистрофическим процессам, характерным для гонартроза.

5. Имплантация в костно-хрящевой дефект поднадколенковой борозды культивируемых в агарозном гидрогеле аллогенных хондроцитов суставного хряща активно способствует репаративной формированию регенерата и его интеграции с окружающими тканевыми структурами, что в течение 3-х мес. приводит к полному заполнению дефекта незрелой хондроидною тканью и фиброзным хрящом.

С. С. Страфун, Д. А. Зубов, А. Т. Бруско, О. А. Костогрыз,
Р. Г. Васильев, Л. И. Остапченко

Имя: *
Е-mail: *
Отзыв: *
Код защиты: * Сменить код
* - поля, обязательные для заполнения
Статьи
Аллергология и иммунология
Какими бывают реакции на укусы насекомых
Какими бывают реакции на укусы насекомых...
Реакции на укусы насекомых отличаются в зависимости от типа и тяжести ...
Популярно-информационные статьи
Законы и правила регулирования абортов
Законы и правила регулирования абортов...
Подобно всем видам медико-санитарной помощи, помощь при аборте подпада...
Неврология
Микроинсульт или транзиторная ишемическая атака. Э
Микроинсульт или транзиторная ишемическая атака. Э...
В обиходе зачастую именно транзиторную ишемическую атаку (ТИА) и назыв...
Новые медицинские учреждения
  • Интернет-магазин
  • SKYDENT
  • «Аксимед» — Клиника современной неврологии
  • Студия красоты и развития
  • Алтес - Сумы
  • Мед Люкс Детокс
  • DietCenter
  • Лико-Мед
  • Сучасна стоматологія Денітка- Луцьк